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肺糖萼的酶促調(diào)節(jié)增強(qiáng)了對肺炎鏈球菌的易感性

很高興與大家分享幾個(gè)月前發(fā)表于American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology的文章。該論文基于Emulate器官芯片技術(shù)在體外構(gòu)建肺芯片模型，用于探索肺糖萼中的糖胺聚糖（如透明質(zhì)酸和硫酸乙酰肝素）在細(xì)菌性肺炎中的作用。在宿主-病原體相互作用的背景下，進(jìn)一步研究 GAG 脫落和重塑的機(jī)制，也為傳染病研究和呼吸醫(yī)學(xué)發(fā)展提供寶貴的意見。

摘要

肺上皮糖萼富含糖胺聚糖（GAG），如透明質(zhì)酸和硫酸乙酰肝素。盡管這些糖胺聚糖廣泛存在于肺部，但其在細(xì)菌性肺部感染中的具體作用仍不明確。為此，我們通過鼻內(nèi)接種肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的小鼠模型，聯(lián)合使用靶向透明質(zhì)酸或硫酸乙酰肝素的酶，研究其對疾病病理、肺部炎癥和肺屏障功能障礙的影響。

透明質(zhì)酸和硫酸乙酰肝素的酶促降解加重了小鼠的肺炎癥狀，表現(xiàn)為疾病評分升高和肺泡中性粒細(xì)胞募集增加。此外，靶向透明質(zhì)酸與肺炎鏈球菌感染相結(jié)合進(jìn)一步加劇了全身性疾病，表現(xiàn)為脾臟細(xì)菌負(fù)荷和促炎細(xì)胞因子血漿濃度升高。

相反，硫酸乙酰肝素的酶解導(dǎo)致感染肺炎鏈球菌的小鼠支氣管肺泡細(xì)菌負(fù)擔(dān)增加、肺損傷和肺部炎癥。肝素酶處理的小鼠還表現(xiàn)出肺屏障完整性破壞，具體表現(xiàn)為如肺泡水腫評分升高和血管蛋白滲漏至氣道。

這一發(fā)現(xiàn)在Emulate人肺泡芯片模型中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，證實(shí)肝素酶處理在肺炎鏈球菌感染期間同樣也會(huì)破壞人肺屏障。值得注意的是，透明質(zhì)酸酶或肝素酶預(yù)處理使人上皮細(xì)胞對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的屏障破壞更敏感（通過跨上皮電阻測量證實(shí)），與小鼠模型結(jié)果一致。綜上，完整的透明質(zhì)酸和硫酸乙酰肝素對限制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺損傷、炎癥反應(yīng)及上皮屏障功能至關(guān)重要。

主要亮點(diǎn)

1：研究人員通過一種傳統(tǒng)動(dòng)物模型和靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)無法實(shí)現(xiàn)的方式，成功復(fù)制了人類肺泡毛細(xì)血管界面。這些見解為呼吸健康提供了新的視角，為改變肺炎治療的療法提供了可能。

2：肺上皮糖萼中的透明質(zhì)酸和硫酸乙酰肝素是防御肺炎鏈球菌感染的重要屏障，其完整性直接影響疾病嚴(yán)重程度。肝素酶通過增強(qiáng)中性粒細(xì)胞趨化因子（如CXCL1、IL-17A）的釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

糖萼破壞加速上皮屏障功能喪失（通過跨膜電阻和肺泡芯片模型驗(yàn)證）。

1：上皮 GAG 的酶促靶向作用會(huì)加重肺炎球菌性肺炎

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小鼠通過鼻內(nèi)接種肺炎鏈球菌（S. pn.）或PBS（作為對照），同時(shí)聯(lián)合透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase, Hya）或肝素酶（Heparinase, Hep）處理。

48小時(shí)后，分析疾病進(jìn)程。結(jié)果顯示，與單純感染組（S. pn. + PBS）相比，Hya和Hep處理組的小鼠體溫顯著下降（36 hpi），體重減輕更為明顯，且肝素酶組的生存率最低。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，肝素酶組的肺炎評分最高（圖1E），表現(xiàn)為肺泡彌漫性損傷，化膿性肺炎。H&E染色結(jié)果顯示，肝素酶組小鼠的肺泡內(nèi)存在大量中性粒細(xì)胞浸潤，同時(shí)伴有明顯的肺泡結(jié)構(gòu)破壞（圖1F）。

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通過分析BAL（支氣管肺泡灌洗液）、肺組織、血液和脾臟中的細(xì)菌負(fù)荷（CFU計(jì)數(shù)），并通過觀察免疫組化觀察肺內(nèi)細(xì)菌分布。經(jīng)過酶處理的小鼠的血管周圍空間中都發(fā)現(xiàn)有大量游離細(xì)菌。只有肝素酶處理的小鼠在支氣管內(nèi)和肺泡內(nèi)空間中才有大量游離細(xì)菌（圖2E）。

2：酶促靶向上皮 GAG 后中性粒細(xì)胞募集和炎癥增強(qiáng)

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通過流式細(xì)胞術(shù)分析了BAL中CD45+白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞（PMNs）以及Ly6Chi炎性巨噬細(xì)胞的比例，并通過ELISA檢測了BAL中IL-17A、CXCL1和CXCL5的水平。

結(jié)果顯示，肝素酶處理組的中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，占CD45+細(xì)胞的70%以上（圖3B, D）。同時(shí)，肝素酶組的IL-17A、CXCL1和CXCL5水平均顯著升高，與中性粒細(xì)胞募集呈正相關(guān)（圖3H-J）。相比之下，透明質(zhì)酸酶處理組的Ly6Chi炎性巨噬細(xì)胞比例顯著降低（圖3C）。

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通過觀察量化BAL中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CCL2濃度，酶促降解糖萼可增強(qiáng)促炎介質(zhì)的釋放。

3：鏈球菌性肺炎介導(dǎo)糖萼脫落并改變脫落的硫酸肝素的硫酸化模式

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在小鼠實(shí)驗(yàn)中，肺炎球菌感染和肝素酶經(jīng)過處理后，肝素二糖會(huì)脫落并重塑。

4：上皮糖萼破壞會(huì)加劇感染引發(fā)的上皮肺屏障損傷

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通過測定BAL總蛋白濃度，組織病理學(xué)評分評估血管周圍和肺泡水腫，發(fā)現(xiàn)H&E染色觀察肺泡出血。與其他組相比，肺炎鏈球菌感染與肝素酶處理相結(jié)合導(dǎo)致最嚴(yán)重的水腫、炎癥和組織損傷。此外，只有肝素酶處理與肺炎鏈球菌感染相結(jié)合才導(dǎo)致肺泡內(nèi)出血（圖6D）。

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通過跨上皮電阻（TEER）評估人類原代肺泡上皮細(xì)胞（HPAEC）在透明質(zhì)酸酶（Hya）或肝素酶（Hep）處理后，再進(jìn)行肺炎鏈球菌感染或模擬感染（PBS對照）后的屏障功能所有受到細(xì)菌刺激的細(xì)胞都表現(xiàn)出抵抗力水平的降低，這表明隨著時(shí)間的推移，屏障功能喪失，并逐漸喪失活力，而酶預(yù)處理則加速這一過程（圖7A和7B）。

使用人類肺泡芯片模型，確定單獨(dú)使用肝素酶處理會(huì)導(dǎo)致表觀通透性略有增加；然而，與肺炎鏈球菌感染相結(jié)合，表觀通透性水平與對照組相比顯著增加（圖7C），肺泡芯片的免疫熒光分析表明，肺炎鏈球菌感染期間的肝素酶處理會(huì)導(dǎo)致上皮損傷和緊密連接標(biāo)志物丟失，而內(nèi)皮基本保持完整（圖7D）。

綜上所述，研究得出結(jié)論，體外糖萼的酶促破壞會(huì)導(dǎo)致上皮屏障通透性的快速變化，從而加速肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而在體內(nèi)，加劇的病理可能是肺屏障破壞、細(xì)菌生長增強(qiáng)和促炎介質(zhì)共同作用的結(jié)果。

5：小結(jié)

肺部的糖萼是一種薄薄的保護(hù)層，在抵御感染方面起著至關(guān)重要的作用。柏林大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員利用肺泡肺芯片研究糖萼分解如何導(dǎo)致肺炎鏈球菌引起的細(xì)菌性肺炎。研究結(jié)果表明，糖萼成分（如透明質(zhì)酸和硫酸肝素）的酶促降解會(huì)加劇細(xì)菌負(fù)荷、炎癥和組織損傷。

該研究還強(qiáng)調(diào)了保持糖萼完整性的潛在治療目標(biāo)，這可以減輕肺損傷并防止全身疾病進(jìn)展。通過利用肺芯片技術(shù)，研究小組以傳統(tǒng)動(dòng)物模型和靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)無法做到的方式成功復(fù)制了人類肺泡毛細(xì)血管界面。這些見解為呼吸健康提供了新的視角，這使得人們能夠更好地了解與人類相關(guān)的疾病機(jī)制，并為潛在的治療干預(yù)措施提供了依據(jù)。從而可能帶來更有效的治療方法。

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